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    從一個病例說起:NGS在肌萎縮側索硬化(ALS)診斷中的應用 ?
    2021-08-02

    從一個病例說起:NGS在肌萎縮側索硬化(ALS)診斷中的應用


    感謝顧衛紅教授和樊東升教授在本文撰寫過程中給予的指導和支持。

    關于ALS

    對于ALS(amyotrophic lateral sclerosis,肌萎縮側索硬化),可能很多人并不熟悉,但是一提到偉大的理論物理學家霍金,大家一定不陌生?;艚饝撌侨蜃钪腁LS患者,他于21歲確診為ALS,一直活到76歲,遠遠超過了ALS患者5年的存活期。后來,標志性的動作、掛滿高科技附件的輪椅、電子合成器發出的語音等成為了一種象征。

    在2014年,由美國波士頓學院前棒球選手發起的ALS冰桶挑戰風靡全球,各界大佬紛紛挑戰。其旨在讓更多人知道被稱為漸凍人的罕見疾病,同時也達到募款幫助治療的目的。國內包括雷軍、周杰倫和王石等各界大佬紛紛響應。

    而這個ALS到底是什么病呢?

    運動神經元病是一種病因未明、主要累及大腦皮質、腦干和脊髓運動神經元的神經系統變性疾病,包括肌萎縮側索硬化(amyotrophiclateral sclerosis, ALS)、進行性肌萎縮、進行性延髓麻痹和原發性側索硬化4種臨床類型。

    ALS是運動神經元病中最常見的類型,一般中老年發病多見,以進行性加重的骨骼肌無力、萎縮、肌束顫動、延髓麻痹和錐體束征為主要臨床表現,生存期通常為3-5年。

    根據GeneReviews(權威遺傳病相關臨床信息資源庫,由多位專家撰寫并經過嚴格的編輯和評審程序所在線發表的數據庫)里的描述:


    ALS的診斷基于臨床特征,電診斷測試以及排除具有相關癥狀的其它健康狀況。分子遺傳學檢測在ALS的遺傳亞型和遺傳咨詢的診斷中發揮著重要作用。


     

    個案介紹

    66歲男性患者于十余年前發現雙手肌肉萎縮,緩慢進展,上肢近端及下肢無明顯異常。通過查體,發現雙手大小魚際肌和骨間肌萎縮,腱反射對稱引出。此外,患者的舅舅及大哥也有類似表現,疾病后期出現吞咽困難。


     

    查體檢查結果

    雙手大小魚際肌和骨間肌萎縮,腱反射對稱引出。


    考慮到患者家族中有ALS的家族史,為了進一步明確診斷,因此送檢賽?;蜻M行全外顯子組測序。結果如下:


    患者檢測到了SOD1基因的一個錯義突變,而SOD1正是肌萎縮側索硬化癥1型的致病基因,并且如手部小肌肉萎縮、肌無力、肌萎縮和吞咽困難等癥狀也與患者或家族史相符。下圖為OMIM中,表型與基因之間的關聯。


    在致病性判讀中,因該變異位于超氧化物歧化酶銅/鋅結合結構域(PM1),錯義突變是造成疾病的主要原因(PP2),在ExAC、gnomAD等數據庫中的發生頻率沒有收錄(PM2),多個蛋白預測軟件預測該變異有害(PP3)。該變異在ClinVar里有1次提交,被定義為致病性(PP5)。HGMD中也有文獻報道該位點有害。根據《ACMG遺傳變異分類標準與指南》,該變異符合”疑似致病性變異“:PM1+PM2+PP2+PP3+PP5。

    并且該病少數情況下可以表現為常染色體隱性遺傳,大多數情況下為常染色體顯性遺傳,存在外顯不全的情況。1995年,de Belleroche等報道該病的外顯率約為80%。在這個案例中,因母親情況未知,如果考慮母親外顯不全或癥狀極其輕微,該家系符合常染色體顯性遺傳,患者的合子類型可以解釋其患病的遺傳模式。

    此外,我們對患者的兩個姨媽(U1、U2)、三個兄弟(S1、S2、S3)、兩個兒子(B1、B2)以及一個侄子(O)進行了目標突變的一代驗證,希望可以發現SOD1突變導致的ALS I型的特殊性。




    根據結果,我們繪制了如下的家系圖:


    通過家系圖和一代驗證結果,我們很意外地發現,患者的四弟(S2)以及大兒子(B1)也是同樣的基因型,但是四弟并沒有表現相應的臨床表型,而根據病例信息,先證者39歲的大兒子于5-6年前出現右手手抖,空手、拿筷子、端酒杯均發生過手抖現象,但并不影響正常生活的情況。SOD1的這個突變究竟在這個家族中扮演了什么角色呢?


    進一步討論

    SOD1這個基因編碼超氧化物歧化酶1,是重要的細胞質抗氧化酶,可以將超氧化物自由基代謝為分子氧和過氧化氫,從而起到防止氧中毒的作用。

    在中國學者去年發表的一篇中國人群SOD1突變譜的研究中,我們這個案例中發現的患者c.125G>A的突變類型也被首次報道。

    并且在該文章的討論部分也就因SOD1突變導致的ALS存在異質性很強,表型和進展在不同患者中都有不同表現的情況做了進一步討論。


    上圖紅框部分文字為研究者列舉的一些患者表現型各異的情況,如G41D、P66S和I113T這三種突變類型分別導致了不同的臨床表現型。

    在該文的最后一段,研究者也對SOD1突變導致ALS患者的臨床異質性做出假設,提出疾病的表型和發展可能受到表觀遺傳因素如性別、修飾基因、環境因素以及其它未知因素等共同影響。

    由此,我們可以聯想到是否由于SOD1基因的外顯不全才導致臨床表型異質性的現象呢?查閱大量相關文獻后,我們發現SOD1基因確實有外顯不全的案例報道,最出名的就是D90A這個變異類型,此前有過常染色體顯性或常染色體隱性遺傳模式的報道。報道發現D90A純合突變致病的家系,并且將SOD1酶活性的喪失視為一種病理機制,但是有些隱性模式的單體型中存在修飾基因會降低SOD1突變體蛋白的毒性。早在2009年,加拿大學者就對SOD1的G27/P28不完全外顯做過研究。研究者招募了12名菲律賓裔的ALS家族的成員,對先證者的SOD1進行測序,并且通過實時PCR和免疫印跡評估SOD1的表達。

    研究結果發現,先證者2號外顯子上的G27/P28的6bp小片段缺失突變是菲律賓人群中最常見的致病突變,而其低外顯率可以解釋為這個突變增加了SOD1 2號外顯子mRNA原本就存在的可變剪接體的表達,導致突變等位基因的表達量減少,這一結果通過免疫組化實驗進行了驗證。

    在這個大家系中,先證者的父母同時攜帶了G27/P28突變(del),但是因為該突變增強了SOD1 mRNA的2號外顯子的天然存在的可變剪接,導致突變等位基因的轉錄減少。

    我們看到,在加拿大研究者的案例中,一個家系中也存在攜帶的突變相同,但是父親患病、母親正常的情況,這一現象是不是跟上下游的SNP多態性位點相關或是另一條正常的基因上的多態性相關呢?

    下圖為G27/P28突變(del)的菲律賓家族的譜系圖?!拘翘柋硎精@得DNA樣本和基因型的12個個體。ALS表型的個體為黑色標記,箭頭處為先證者,斜線表示已故。單體型分析的標記顯示在左側,對先證者和其父母做了單體型分析?!?/span>

    以此類推,在我們的案例中,是不是也存在這樣的一個增強或削弱作用導致同一個突變類型的攜帶者有著不一樣的表型呢?我們是否可以發現導致SOD1外顯不全的另一種機理?


    一些具體的建議

    我們對ALS患者及其家庭有如下建議:


    確診后的治療

    根據GeneReviews中的建議,患者可以服用利魯唑來對ALS進行治療;如有延髓癥狀,使用三環類抗抑郁藥和抗膽堿能藥來減少口腔分泌物,從而減少抽吸的需要;使用抗抑郁藥如Nuedexta(右美沙和奎尼?。﹣砜刂萍傩匝铀璧挠绊?;服用巴氯芬和苯二氮卓類藥物減輕痙攣和肌肉痙攣。


    患者兒子的風險評估和相關監控

    因患者兒子的基因型與患者基因型一致,患者的兒子需要每隔一段時間進行一次專門的多學科ALS臨床評估,如神經系統檢查、肺功能檢查等,以確保早發現早干預,提高患病時期的生活質量。


    產前診斷

    若與患者相同基因型的兒子要養育下一代,可通過產前診斷來避免攜帶者或者患兒的誕生。詳情見下圖中GeneReviews給出的產前診斷意見。



    結語

    2018年5月22日,國家衛生健康委員會、科技部、工業和信息化部、國家藥品監督管理局、國家中醫藥管理局等五部門聯合發布了第一批罕見病目錄,共涉及121種疾病,ALS(肌萎縮側索硬化)就在其中。ALS固然可怕,但是通過分子診斷的方法來早期確診并采用科學的干預和治療措施或可在很大程度上提高患者的生活質量,延長患者壽命。更重要的是,在ALS患者家庭中,通過分子診斷和產前診斷的方法,可盡量避免這個罕見遺傳病在家族中傳遞,最大可能的緩解ALS對患者及其家庭的困擾。



    參考資料:

    1、AdamMP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., editors. GeneReviews? [Internet]. Seattle(WA): University of Washington, Seattle; 1993-2018. Available from:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116/

    2、OnlineMendelian Inheritance in Man, OMIM?. McKusick-Nathans Institute of GeneticMedicine, Johns Hopkins University (Baltimore, MD), {2018}. World Wide WebURL: https://omim.org/

    3、Zinman,L., H. N. Liu, C. Sato, Y. Wakutani, A. F. Marvelle, D. Moreno, K. E. Morrison,et al. “A Mechanism for Low Penetrance in an ALS Family with a Novel SOD1Deletion.” Neurology 72, no. 13 (March 31, 2009): 1153–59.

    4、Wei,QianQian, QingQing Zhou, YongPing Chen, RuWeiOu, Bei Cao, YaQian Xu, Jing Yang,and Hui-Fang Shang. “Analysis of SOD1 Mutations in a Chinese Population withAmyotrophic Lateral Sclerosis: A Case-Control Study and Literature Review.”Scientific Reports 7, no. 1 (December 2017). https://doi.org/10.1038/srep44606.


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