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    AJHG | 斑馬魚模型提示GOT2基因相關癲癇性腦病治療策略
    2021-07-30

    AJHG | 斑馬魚模型提示GOT2基因相關癲癇性腦病治療策略

    早期嬰兒癲癇性腦病會導致運動異常、智力障礙及全面發育落后,預后較差,對患兒的健康造成極大的威脅。在疾病早期進行明確診斷是指導正確治療的關鍵。GOT2編碼的轉氨酶可以催化草酰乙酸和谷氨酸可逆地轉化為天冬氨酸和α-酮戊二酸,為線粒體中蘋果酸-天冬氨酸穿梭循環(MAS)中的重要部分。近期AJHG雜志發表的文章《Bi-allelic GOT2 Mutations Cause a Treatable Malate-Aspartate Shuttle -Related Encephalopathy》,揭示了GOT2基因在MAS中的重要作用,并進一步建立了GOT2基因突變與癲癇性腦病的關聯。研究人員通過建立斑馬魚疾病模型和藥效評估,提出吡哆醇及絲氨酸補充可能作為GOT2缺乏患者的治療策略。該研究為GOT2缺乏患者的生化異常提供了機制解釋,并為患者提供了可能的指導治療方案。


    患者臨床特征及變異發現

    本研究納入3個無關家庭的4例患兒,4名患兒均存在進行性的小頭畸形、進食困難,早期表現為代謝相關的癲癇性腦病,隨后出現智力及運動障礙。生化檢測結果顯示,患者血漿中乳酸含量及血氨含量較高,并且臨床癥狀嚴重的患者1血漿絲氨酸水平較低。值得注意的是,采用絲氨酸及吡哆醇治療,顯著緩解了其中2例患者的癲癇發作和神經發育缺陷。全外顯子檢測(WES)結果顯示4例患者存在GOT2基因的復合雜合突變及純合突變,均為框內缺失或錯義變異(圖1)。Sanger測序證實了GOT2變異的存在及其在家族中的共分離情況。隨后研究者進行蛋白建模,預測變異對蛋白功能的影響,結果顯示,變異會降低GOT2的催化活性并影響蛋白的整體構象,進而可能影響蛋白的功能。



    圖1 患者家系和GOT2基因變異信息 


    GOT2基因變異功能驗證

    利用患者的成纖維細胞(Fib)進行Western blot,結果顯示患者1(P1)GOT2表達顯著低于對照組,患者2-4(P2-4)的GOT2表達也有所下降,該結果符合P1展現最嚴重表型的臨床觀察。研究者構建了GOT2基因敲除的HEK293細胞系,驗證GOT2在Fib及HEK293細胞系中的表達情況與活性水平。Fib實驗中,P1-4中GOT2的活性顯著低于對照組,分別為對照組平均值的8%,21%,21%和18%,這種缺陷可以被WT GOT2 cDNA挽救。細胞系實驗中,GOT2敲除的HEK293細胞系幾乎不表達該蛋白,細胞內GOT2蛋白活性也幾乎喪失。


     

    圖2 GOT2的表達及活性驗證


    Fib及HEK293 GOT2-/-中絲氨酸的合成

    由于臨床發現吡哆醇和絲氨酸治療對該類癲癇性腦病患者有良好的療效,故研究者進一步分析了Fib及HEK293 GOT2-/-細胞中絲氨酸的合成情況。結果顯示,P1-4患者的Fib中絲氨酸的10小時合成量分別僅有野生型對照的34%,55%,52%和33%,GOT2-/-敲除細胞系中絲氨酸及甘氨酸的合成嚴重受損。研究者假設這種降低是由于GOT2缺陷影響了MAS過程,導致胞質中NADH/NAD+的比例增加。研究者試圖通過恢復細胞氧化還原水平來糾正絲氨酸的合成能力,利用甘油及丙酮酸對細胞系進行孵育,結果顯示2.5mmol/L和5mmol/L的丙酮酸可以顯著提高絲氨酸與甘氨酸的合成量。



    圖3 GOT2突變影響絲氨酸的合成


    斑馬魚got2a 基因敲降引發癲癇表型

    研究者利用Morpholine (MO)技術構建斑馬魚got2a敲降模型,觀察到小頭畸形、心包水腫、身體彎曲的表型;電生理結果顯示,突變斑馬魚出現癲癇樣腦電信號,發作次數及持續時間均顯著高于野生型。這一結果證實了該基因與癲癇性腦病表型及大腦發育缺陷的關聯。研究者隨即利用該模型進行治療干預的探索,采用不同濃度的吡哆醇、絲氨酸、丙酮酸和脯氨酸斑馬魚幼魚進行干預處理。結果顯示吡哆醇和絲氨酸可以挽救got2a 敲降斑馬魚的嚴重表型,并且提高其生存率,同時減少了癲癇發作的次數及持續時間。該結果為GOT2突變相關癲癇性腦病患者的臨床治療提供了指導依據。



    圖4 got2a 敲降斑馬魚的表型及藥物干預結果


    總  結

    GOT2缺乏會導致嬰兒早期的癲癇性腦病,小頭畸形及一系列生化指標的異常。在GOT2缺乏患者中觀察到的絲氨酸和甘氨酸合成的減少,可能是由于MAS功能異常導致NADH/NAD+比例升高,進而對NAD依賴的酶和代謝途徑產生影響。吡哆醇是絲氨酸生物合成的必要因素,吡哆醇干預可能通過恢復NADH/NAD+的氧化還原平衡,促進絲氨酸的合成。

    GOT2缺乏與其他MAS異常的疾?。ㄏ嚓P基因:MDH2, SLC25A12, SLC25A13)和絲氨酸代謝疾?。ㄏ嚓P基因:PHGDH, PSAT1, PSPH)類似,在臨床中需要通過高乳酸、高血氨及低絲氨酸等臨床表征對患者進行鑒別診斷。如果這一基因型與表型的關聯及治療策略在更多樣本的人群中被證實,GOT2缺乏導致的癲癇性腦病將有望成為可治療的疾病。


    參考文獻:van Karnebeek Clara D M,Ramos Rúben J,Wen Xiao-Yan et al. Bi-allelic GOT2 Mutations Cause a Treatable Malate-Aspartate Shuttle-Related Encephalopathy.[J] .Am J Hum Genet, 2019, 105: 534-548.


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