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    AJHG | SEMA6B末端外顯子截短突變導致進行性肌陣攣癲癇
    2021-07-30

    AJHG | SEMA6B末端外顯子截短突變導致進行性肌陣攣癲癇

    2020年4月2日,日本橫濱市立大學醫學院Naomichi Matsumoto課題組在The American Journal of Human Genetics 雜志上發表了名為 《De Novo Truncating Variants in the Last Exon of SEMA6B Cause Progressive Myoclonic Epilepsy》 的研究報告。該報告通過對346例患者家系的WES數據分析及斑馬魚模型上的功能驗證,指出SEMA6B基因最后一個外顯子上的截短突變是導致進行性肌陣攣癲癇的遺傳原因。此項工作中,作者采用CRISPANT技術建立斑馬魚同源基因移碼突變模型,通過形態學和行為學表型測試,評估了該同源基因不同區域上突變的影響,幫助建立了SEMA6B基因末端外顯子截短突變導致進行性肌陣攣癲癇的新關聯。



    新發突變 (De Novo Variants, DNVs) 可導致許多遺傳性疾病。全外顯子測序(WES)分析發現致病性DNVs往往聚集在一些特定區域, 其中一個區域是基因最后一個外顯子及倒數第二個外顯子的最后50bp。該區域發生的截短DNVs會逃逸無意義介導的mRNA降解,于是將該區域稱為NMD(-)。這類突變可能會導致顯性負效或功能獲得效應。


    作者首先收集了截短DNVs在每個基因NMD(-)區域內的發生概率,并結合346例發育性癲癇性腦?。―EE)患者家系的WES數據,進行了截短DNVs在NMD(-)區域的富集分析。結果顯示截短DNVs在SEMA6B基因中顯著富集。通過對346例患者家系的初始分析,加上對患有DEE和發育障礙的1,406和4,293個獨立個體的進一步篩查,作者在來自不相關家庭的5位患者中發現了位于SEMA6B基因NMD(-)區域的4個截短DNVs。這5名患者都表現出持續的進行性肌陣攣性癲癇,具體表現為不能正常行走和正常說話、輕度的小腦萎縮、肌陣攣、癲癇發作和進行性神經功能減退等。這4個突變都位于SEMA6B基因的最后一個外顯子上,從而導致細胞內結構域 (ICD) 的截短(圖1)。


    圖1 DNVs位于SEMA6B基因NMD(-)區域的患者家系信息和突變位點分布


    為了確定SEMA6B基因NMD(-)區域的截短突變是否影響神經系統功能,作者建立了斑馬魚模型來進行突變影響的研究。作者采用CRISPANT技術對斑馬魚同源基因sema6ba和sama6bb進行基因編輯,分別在2號外顯子和17號外顯子(最后一個外顯子)上設計crRNA來引入突變, 建立F0代嵌合模型crispant來進行表型觀察。作者在受精后24小時 (24 hpf) 對斑馬魚胚胎進行明場顯微鏡觀察,并使用乙?;⒐艿鞍兹旧ㄝS突標記物)對中樞神經系統(CNS)進行熒光成像和神經結構的測量。結果顯示sema6ba和sema6bb 基因F0代crispant表現出整體發育缺陷和CNS結構異常(圖2),并且17號外顯子突變組相較2號外顯子突變組表型更為嚴重。這一結果表明斑馬魚模型能很好地再現人類患者的相關表型,并模擬末端外顯子NMD(-)區域截短突變的致病機制。


                   

    圖2 斑馬魚sema6ba/b基因末端外顯子的破壞導致嚴重的發育及中樞神經系統缺陷


    由于SEMA6B基因在抑制性(GABAergic)神經元中有較高表達,因此該基因功能的破壞將有可能導致癲癇發生。為驗證這一假設,作者在斑馬魚模型上進行了促癲癇藥物戊四氮(PTZ)敏感性測試。作者使用不同濃度的PTZ處理受精后7天(7 dpf)crispant幼魚及未注射對照組,通過運動軌跡跟蹤,測量了PTZ暴露后幼魚的總游動距離。作者觀察發現PTZ處理會增加幼魚的游動行為(階段I),導致快速的“漩渦”運動(階段II),或導致1-3s的陣攣式發作(階段III)和活動喪失(圖3)。量化結果顯示對照組和crispant組的幼魚總游動距離以劑量依賴的方式增加,但相比對照組,crispant幼魚對PTZ的敏感性增加,特別是在低濃度PTZ條件下crispant幼魚更容易表現出階段III類似陣攣的行為,并且17號外顯子突變組相較2號外顯子突變組表型更為顯著。這一結果表明在PTZ影響下斑馬魚sema6ba和sema6bb基因末端外顯子突變更容易導致癲癇發生,這為SEMA6B基因NMD(-)區域截短突變與癲癇表型的關聯提供了證據。



    圖3 PTZ影響下sema6ba和sema6bb crispant更容易發生癲癇行為


    在本研究中,作者發現(1)DEE患者群體中,DNVs在SEMA6B基因的NMD(-)區域有很強的富集;(2)SEMA6B同源基因末端外顯子截短突變的斑馬魚crispant模型表現出神經系統結構異常,并且在PTZ影響下更容易產生癲癇行為。作者進而指出SEMA6B基因最后一個外顯子上的截短突變是導致進行性肌陣攣癲癇的遺傳原因。


    原文鏈接:https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2020.02.011



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