<pre id="zd5db"></pre>

    <p id="zd5db"><del id="zd5db"><mark id="zd5db"></mark></del></p><pre id="zd5db"><ruby id="zd5db"><var id="zd5db"></var></ruby></pre>
    <pre id="zd5db"></pre>
    越南精品无码视频专区在线,精品三级久久久久电影我网,九九热线精品视频首页,色久综合网精品一区二区,无码精品第1页_影院
    賽?;蚬_課《高通量篩選在漸凍癥藥物研發中的應用》
    2021-07-30

    賽?;蚬_課《高通量篩選在漸凍癥藥物研發中的應用》

    Part-1

    嘉賓介紹

    吳晨博士,本科畢業于南京大學生命科學院,博士畢業于北京大學生命科學院。個人興趣為如何降低神經退行疾病中錯誤折疊的蛋白聚合物、神經細胞中的信號傳遞、以及基因敲除/修復技術在神經退行疾病上的應用。目前在哈佛大學干細胞與再生生物學院做博士后研究,主要方向為利用誘導多能性干細胞(iPSC)平臺體外構建漸凍癥(ALS)疾病模型,尋找新型靶向藥物以及漸凍癥中運動神經損傷的機理。


    Part-2

    公開課環節


    大家好,我是來自美國哈佛大學干細胞與再生生物學的吳晨博士,目前從事漸凍癥以及其它神經退行疾病的藥物研發與機理研究。感謝賽?;虻难埡痛蠹业膮⑴c。今天和大家簡單分享一下在藥物研發中常用的高通量篩選的應用。同時我會簡略地介紹一下基因編輯技術在神經疾病治療中的作用和前景。



    這次的內容大概分為三個方面:首先是漸凍癥(ALS)的背景知識,然后我會介紹高通量篩選的流程方法,在ALS藥物開發中的應用包括幾個實例。最后我會簡要介紹一下基因編輯技術和高通量篩選的結合應用以及基因編輯在疾病治療中的前景。



    上圖是比爾蓋茨在進行冰桶挑戰。冰桶挑戰開始讓大家更多地關注一個可怕的疾病,那就是漸凍癥,或者叫漸凍人癥。冰桶挑戰為漸凍癥研究和護理籌集了大量資金。



    漸凍癥的學名是肌萎縮性側索硬化癥: Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS),這是一種漸進性的致命神經退行疾病。病癥主要影響運動皮質區的上運動神經以及腦干和脊髓的下運動神經,導致運動神經退化。在正常人體內,大部分肌肉尤其是骨骼肌都被運動神經控制,當神經信號傳遞時,骨骼肌可以正常接收運動神經指令,進行收縮或擴張。在ALS患者體內,運動神經受損,逐漸喪失與骨骼肌的聯系,導致肌肉失去指令控制,病人會逐漸喪失運動功能,最后無法呼吸,吞咽,直至死亡。值得一提的是,運動神經損傷并不影響心肌、腸胃消化道蠕動以及大腦思維。



    目前全世界大約有45萬ALS患者,占總人口數的1~2%。ALS是一個較晚發病的疾病,通常在40-70歲之間發病,患者一般在2-5年內死亡,只有10%患者可以生存10年以上,5%可以存活20年以上。ALS的診斷相對比較復雜,需要一系列的綜合診斷,通過排除其它肌萎縮疾病來確認。



    ALS一般可以分為兩個大類。5-10%為家族性或者叫遺傳性ALS,主要由基因突變引起,這部分病人可以通過基因測序,分析家族歷史來進行早期確認。90-95%為散發性,致病因素很復雜,目前并沒有非常確定的結論。



    在目前的研究和認知中,ALS的致病機理分為兩大類,即細胞自主性和非細胞自主性。細胞自主性指的是神經細胞自身的問題,包括線粒體功能紊亂、氧化應激、免疫功能失常、谷氨酸毒性、毒性蛋白聚集。非細胞自主性指的是和神經細胞共存的其它細胞異常導致的神經細胞退行現象,如小神經膠質細胞會影響運動神經細胞。因為致病因素的多樣性和復雜性,目前FDA只批準了2個藥物,但是對于患者的作用非常有限。值得一提的是,毒性蛋白聚集,在大量的ALS患者中都有發現。不僅如此,幾乎所有的神經疾病都涉及到蛋白聚合物的毒性和擴散,也是目前大量神經疾病研究中的重點。



    目前大部分的神經退行疾病都沒有有效的藥物,所以整個領域對于藥物研發都很重視。藥物研發的流程主要分為:藥物開發、臨床前試驗、臨床測試。而第一個藥物開發和靶點開發就需要用到高通量篩選技術。



    高通量篩選技術是以分子水平和細胞水平的實驗方法為基礎,以微板形式作為實驗工具載體,以自動化操作系統執行試驗過程,在同一時間檢測數以千萬的樣品,再以計算機分析處理實驗數據。



    HTS應用廣泛,因為其優點明顯:省時、高效、準確、低耗。



    在藥物研發中,獲得先導化合物(lead compound)是極為重要的第一步。首先我們需要針對我們的需求設計疾病模型(體外或者體內),然后通過高通量篩選獲得初步有效的化合物,隨后通過確認效果找到一個或幾個有效的靶點已知的化合物,即苗頭化合物,再在此基礎上設計毒性更低,效果更好的一族化合物,即為先導化合物。這樣就算藥物研發第一大步驟的完成。



    HTS根據目標不同,可以分為不同的篩選策略,常用的有兩種:基于靶點的篩選和基于表型的篩選。在已知靶點的情況下,多使用前者,如腫瘤靶向藥物篩選;在未知靶點情況下,以產生變化的表型為讀出,常使用后者。



    表格是部分FDA批準的來源于高通量篩選獲得苗頭化合物的腫瘤藥物,都是基于已知靶點進行的HTS。下面我將以卵巢癌藥物奧拉帕尼(Olaparib)為例說明從HTS獲得苗頭化合物和先導化合物的重要。



    PARP很早就被揭示過與BRCA1/2失活后DNA損傷修復有關,針對卵巢癌BRCA1/2突變,研究人員開始關注PARP抑制劑。奧拉帕尼最初來源于高通量篩選產物phthalazinones,其對于PARP有一定的抑制作用。以其為苗頭化合物,進行優化。從05-06年優化獲得細胞活性與穩定的代謝活性,到08年優化獲得的對BRCA1缺失細胞的選擇性毒性。整個過程歷經多個優化過程,歷時十多年。



    以上是基于靶點的篩選,我們已知了PARP靶點對于BRCA1的重要性,再進行的篩選和優化。但是對于很多疾病,有很多靶點是未知的,這就涉及了基于表型的篩選。根據表型的差異(細胞生存與凋亡、細胞功能性獲得等)獲得一系列不同活性候選化合物,這些化合物可能針對不同靶點有不同的作用機理。這種方法也是目前最常用的方法。



    那么在ALS藥物開發中,HTS有怎么樣的應用?目前分為體外篩選與體內篩選兩大方面。體外的篩選又主要有AI層面、非細胞層面與細胞層面;體內主要是動物模型篩選。這里我們主要介紹一下細胞層面的篩選,這是目前最主要的苗頭化合物來源。



    對于運動神經這類高度依賴功能性的細胞,在高通量的基礎上,我們通常還需要另一個技術的結合,就是高內涵(high-content)。高內涵技術是一種用數碼影像的方式獲得篩選細胞多方面生物信息的一種方法。這種技術可以獲得細胞水平上多個指標的分析并可以通過對影像圖片進行不同種類的分析獲得不同方向的研究結果,優勢明顯。



    上圖為在ALS藥物研發流程中,高通量篩選需要歷經的過程。



    疾病模型的建立在ALS藥物研發(包括其它疾病的藥物研發)中非常重要。在ALS藥物篩選的早期,幾乎沒有以人類疾病細胞建立的模型,所以大量的在其模型上獲得的有效藥物無法通過臨床試驗。



    這是一個經歷臨床測試的ALS藥物的表格,幾乎所有的藥物都失敗。以最近的兩個藥物Dexpramipexole和Olesoxime為例,它們分別是從人神經細胞瘤和大鼠神經細胞中篩選獲得,但是在臨床上都顯示對患者無效。由于倫理原因,早期幾乎無法建立人源疾病模型。


    隨著iPSC技術的廣泛應用,很多疾病都可以通過iPSC技術建立體外模型,這對于藥物開發意義重大。通過獲得ALS患者的體細胞,建立干細胞系,體外分化至運動神經細胞,這樣就獲得了疾病的體外模型。


    上表顯示使用iPSC/ESC平臺獲得的體外模型進行的篩選,包括但不限于各類神經疾病。


    以我的部分工作為例:大家知道,幾乎所有的患者在被診斷出ALS前,患者的運動神經就已經被損傷了,我就需要篩選使疾病運動神經恢復健康的藥物。首先,我通過iPSC技術,獲得了我想研究的某一類ALS的疾病模型(SOD1突變),在小孔中接入細胞,模擬疾病對運動神經進行損傷,損傷后篩選能夠讓神經恢復功能的藥物。通過收集細胞的各方面數據,進行大量的數據分析,找到需要的藥物,再進行確認和優化。整個篩選方法的設計和數據的獲得對于最后結果非常重要。


    通過HTS,發現了一系列的有效化合物,其中Kenpaullone效果最好最穩定。但是Kenpaullone不是單一靶點化合物,需要我們確認是哪個靶點發揮作用。


    通過一系列的實驗,我們確認了靶點為MAP4K4。針對這個靶點的特異性化合物有著非常好的保護效果。不僅能夠抑制運動神經死亡,而且極大的保護其功能。同時也摸清了該靶點的作用機理,為臨床實驗打下基礎。


    上圖為HTS中的幾個關鍵節點。


    HTS在帕金森疾病中的應用。已知aSN蛋白聚合物在帕金森疾病中的毒性(已知靶點),通過篩選獲得58個有初步抑制作用的化合物,經過確認找到6個效果最好的化合物。后續可以通過優化獲得靶點特異性更好,效果更好的先導化合物。


    HTS在阿茲海默癥中的應用。同樣針對Ab42蛋白聚合物,設計篩選,當化合物能夠抑制Ab聚集,就可以通過正確折疊的GFP蛋白表達綠色熒光,結合已知靶點和表型篩選,獲得結果。


    基因編輯技術是當前非常熱門與有效的技術,當基因編輯技術與HTS結合,可以完成大規模的未知靶點篩選。以ALS中突變基因C9為例,臨床中發現患者體內有大量精氨酸富集的蛋白聚合物,而這種聚合物有極大的細胞毒性。通過對模型細胞中基因組規模的敲除,科研人員可以得知哪些基因的缺失可以抑制蛋白聚合,從而為治療提供新的靶點。


    此外,基因編輯技術的廣泛應用還包括當前熱門的基因治療。簡單來說,就是通過CRISPR技術在體內對突變基因進行剪切,以達到治療疾病的目的。


    以上為總結。


    致謝!


    Part-3

    問答環節

    觀眾a:

    吳老師您好,漸凍癥很大程度上是基因突變引起的,這些基因突變是否導致了功能缺失?能否通過表達正常的基因來干預疾病的進程同時治愈疾???

    吳晨老師:

    您好,漸凍癥的治療絕大多數是無法通過表達正?;騺磉_到的,因為大多數的基因突變,導致的不是功能性的缺失,而是一種細胞毒性。比如很常見的SOD1的突變,也就是超氧化物歧化酶的突變,這個突變會導致突變蛋白錯誤折疊,最后聚合,突變蛋白也會和正常蛋白聚合,所以無法通過正常蛋白表達來治療疾病。

     

    觀眾b:

    老師您好,在高通量篩選中,如何減少假陽性結果的出現?如何增加篩選的可靠性?

    吳晨老師:

    篩選中的可靠性最主要是篩選體系和篩選策略的選擇,尤其是在篩選策略上,要保證陽性對照和陰性對照之間的差距,同時通過梯度實驗設計來減小誤差。

     

    觀眾c:

    吳老師您好,請問高通量篩選策略的選擇,是用表型篩選好還是靶點篩選好?

    吳晨老師:

    這兩種篩選策略都很常用,一般對于靶點確定的,靶點篩選會更直接,但是相對會有局限性。比如針對Ab42的篩選,會出現很多有效的化合物或者抗體,但是目前所有抗體都沒有有效的。所以現在很多都是兩種方法結合,既針對靶點,也看表型。

     

    觀眾d:

    吳老師您好,感謝您的分享,可以簡單介紹一下蛋白聚合物的毒性方面的研究嗎?

    吳晨老師:

    蛋白聚合物的毒性目前是整個神經疾病領域的熱門,因為在很多或者說絕大多數的神經疾病中都有發現各類蛋白聚合物。以我做的漸凍癥為例,幾乎所有的突變都會導致突變蛋白的錯誤折疊,這種錯誤折疊的蛋白會聚合在一起,變成類似朊病毒一樣的聚合物。更可怕的是,不僅突變蛋白會聚合,突變蛋白也會和正常蛋白聚合,而這種蛋白聚合物會嚴重影響運動神經之間的正常交流,最后導致運動神經的死亡。目前很多研究機構都在針對這方面尋找能夠加速降解蛋白聚合物的藥物,有的甚至先在酵母中確定靶點,再在人細胞上驗證,這樣可以先獲得靶點。

    觀眾d:

    所以針對點突變導致錯誤折疊這種類型的突變,從基因層面來說,移碼突變導致的截短蛋白會不會癥狀更輕?

    吳晨老師:

    相對來說,整基因敲除或降低表達會減輕癥狀,移碼突變不會或者說不一定會。目前的基因治療針對的幾乎都是整基因敲除或者抑制,但是最近有文獻發表指出CRISPR會導致RNA被修改,所以目前基因療法的安全性是個大問題。

     

    觀眾e:

    老師您好!在漸凍癥藥物開發中,獲得苗頭化合物后,需要優化的方向是什么?

    吳晨老師:

    一般優化都是加強靶點特異性,降低毒性等,針對神經疾病一般要強調血腦屏障的穿透,很多藥物最早是沒有穿透性的,也就無法作用到中樞神經系統。順便再說一點,在漸凍癥中,蛋白聚合物會出現在神經細胞周邊的astrocyte里,但是對其沒有毒性,只對運動神經有毒性。


    越南精品无码视频专区在线在线观看_绅士Go影剧网 成人内容...