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    賽?;蚬_課《DNA修復缺陷在腫瘤精準治療中的價值及應用》
    2021-07-29

    賽?;蚬_課《DNA修復缺陷在腫瘤精準治療中的價值及應用》

    Part-1

    嘉賓介紹

    蔡木炎,哈佛醫學院Dana-Farber Cancer Institute博士后,主要從事腫瘤DNA損傷與修復在腫瘤個體化治療的應用及機制研究。


    Part-2

    公開課環節

    大家好,我叫蔡木炎,原來是中山大學附屬腫瘤醫院病理醫生,現在為Dana-Farber cancer Institute博士后,我主要研究方向為腫瘤DNA repair機制及其在腫瘤個體化治療中的應用。感謝組織者的邀請,非常高興能借助這個平臺與大家交流。今天我將跟大家一起探討DNA修復缺陷在腫瘤精準治療中的價值及應用。


    今天我將從以下三個方面進行匯報:首先我會從總體上介紹DNA修復的類型及通路,隨后將討論腫瘤DNA修復缺陷在化療藥物耐藥、靶向治療中的應用。


    真核細胞在各種內源性(如氧自由基、復制錯誤)與外源性因素(如射線、紫外線、烷化劑等)作用下,將發生DNA損傷,機體通過激活一系列修復機制進行DNA修復(在損傷局限性、小片段時較為多見);同時,DNA損傷也可以導致細胞周期阻滯、基因突變,從而導致腫瘤發生遺傳性疾病。


    DNA損傷是基因突變、腫瘤形成的重要機制,據報道,人類80%以上腫瘤都存在著DNA修復缺陷。正常細胞,在環境與有害試劑作用下出現DNA損傷,如果損傷可逆且細胞修復機制完善,細胞成功地完成DNA修復;當細胞本身存在著某些影響細胞功能的內在突變時,細胞將不能進行有效修復,從而導致體細胞突變,隨后細胞通過激活癌基因、削弱凋亡、滅活抑癌基因等途徑改變蛋白表達、結構以及調節蛋白,最終導致腫瘤的發生。


    DNA在各種因素作用下,可發生單鏈斷裂、堿基錯配、堿基損傷、雙鏈斷裂、鏈間交聯、鏈內交聯等損傷類型。


    當DNA出現以上各種損傷類型,細胞將激活相應機制進行修復:如DNA出現單鏈斷裂、單堿基損傷時,機體通過激活堿基切除進行修復;當DNA出現龐大的交聯時,通過核酸切除進行修復;當出現堿基錯配時,啟動錯配機制進行修復;出現雙鏈斷裂時,啟動同源重組及非同源末端連接進行修復等。


    首先我們講DNA堿基切除修復途徑。堿基切除修復(BER)可以從DNA糖基化酶識別受損堿基,核酸內切酶APE1識別無嘌呤、嘧啶AP位點,或通過末端加工蛋白質識別單鏈斷裂開始。 BER可以通加摻入單個核苷酸或通過加入兩個或幾個核苷酸來進行。有一些BER相關蛋白在BER起著非常重要的作用,如紅色環蛋白質表示它們在小鼠中被敲除時是致命的。


    當DNA被陽光損傷時,根據DNA是否具有轉錄活性(轉錄偶聯修復)或不(全局切除修復)識別損傷而不同。在初始識別步驟之后,以類似的方式修復損傷,最終結果是恢復正常核苷酸序列。


    錯配修復堿基錯配修復途徑,MMR胚系突變是Lynch綜合征發生的致病因素。哺乳動物MMR的機制:首先,不匹配的DNA堿基對被MSH2-MSH6(MutSα)或MSH2-MSH3(MutSβ)識別。在錯配識別后招募MLH1-PMS2(MutLα)至MutSα或MutSβ。PCNA通過RFC加載到DNA后與MutLα相互作用。PCNA-MutLα相互作用介導PMS2的內切核酸酶活性。EXO1介導錯配DNA的切除。RPA與切除產生的單鏈RNA結合以保護該單鏈,并且還促進切除終止。DNA聚合酶合成新DNA以填充切除的堿基,并且新合成的鏈通過DNA連接酶修復。


    HR的分子機制:MRN復合體感受DSB并切除3‘-DNA斷裂末端。然后RPA蛋白結合并穩定ssDNA。Rad52與調節物一起解除RPA并招募Rad51。然后Rad55-Rad57二聚體結合以保護和穩定Rad51核絲,并且Rad54 ATPase幫助Rad51與同源鏈相互作用。


    下面我們簡單討論NHEJ機制。當DNA發生雙鏈斷裂時,斷裂的雙鏈被Ku異二聚體快速結合;Ku70 / 80作為底物招募NHEJ各成員到DSB; 如果DSB末端不能連接,它們將被特定的DNA末端加工因子處理。 DSB通過DNA連接酶IV連接完成NHEJ。


    接下來將介紹腫瘤DNA修復缺陷在傳統化療藥物耐藥中的作用。


    MGMT(O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉移酶)是一種可以通過去除鳥嘌呤O6位烷基基團來防止細胞DNA發生突變的一種DNA修復酶,Hegi等發現MGMT作為惡性膠質瘤化療耐藥的主要機制。他們發現Low表達MGMT與惡性膠質瘤預后不良相關,MGMT啟動子甲基化預示膠質瘤患者對替莫唑胺及放療敏感。


    約15%結腸癌患者存在錯配修復(MMR)功能的缺陷。Zaanan等研究人員收集了兩個用FOLFOX(亞葉酸,氟尿嘧啶和氟尿嘧啶)治療的結腸癌3期試驗,評估患者中錯配修復(MMR)表型對患者預后的影響。結果發現MMR缺陷與患者預后正好相關。


    2010年著名的臨床研究發現:輔助治療顯著改善了pMMR腫瘤患者的DFS;與單獨手術的患者相比,接受FU的dMMR腫瘤患者的DFS沒有改善;在II期的dMMR結腸癌患者中,Fu治療與總體生存率降低相關。


    機體存在多條DNA修復機制,盡管具有DNA損傷底物特異性,但卻常有交叉,互為代償。而大部分腫瘤常伴有DNA修復缺陷,因此,針對某DNA修復缺陷的補償通路設計抑制劑具有很強的細胞殺傷效應(合成致死方式)。


    Farmer團隊發現PARP抑制劑處理顯著增加DNA損傷(r-H2AX foci明顯增加)。為了確定這些損傷如何修復,研究者探討了PARP抑制劑是否引起了RAD51的聚焦形成。BRCA野生型腫瘤細胞,PARP抑制劑處理增加RAD51 foci,而BRCA突變型腫瘤細胞卻沒發現有RAD51 foci。這些結果提示PARP抑制劑導致的DNA損傷需要涉BRCA1和BRCA2介導同源重組的機制修復。為什么BRCA1和BRCA2缺陷細胞對PARP抑制顯示出極高的敏感性?PARP是堿基切除修復過程中DNA單鏈斷裂的有效修復所必需的,并且PARP抑制導致DNA持續的單鏈間隙。如果復制叉遇到這些缺口,就會發生停頓并且單鏈間隙可能退化為DSB。通常這些DSBs可以通過RAD51依賴性同源重組來修復,BRCA1和BRCA2參與其中。在沒有BRCA1或BRCA2的情況下,復制分叉無法重新啟動并折疊,從而導致持久性染色體斷裂。


    2009年6月24日,《New England Journal ofMedicine》在線發表的一項小型1期研究中顯示,在23例表現BRCA1或BRCA2突變的難治性乳腺癌、卵巢癌及前列腺癌患者中,Olaparib治療可使病變消退或穩定,而在37例與此基因突變無關的腫瘤患者中未顯示任何抗腫瘤活性。


    正常細胞抑制PARP酶后,細胞可通過BRCA基因進行同源重組修復;而在BRCA缺陷腫瘤細胞中,抑制PARP酶將形成協同致死性,最終導致細胞死亡。


    最后我們討論目前比較熱門的話題,DNA修復缺陷在腫瘤免疫治療中的應用。


    腫瘤MMR基因缺陷可預測PD-1抑制劑治療反應。2017年science雜志公布了最新的臨床研究:發現腫瘤的MMR基因缺陷可以作為預測癌癥病人對PD-1抑制劑免疫療法反應程度的臨床標記物。在該研究中,研究者收集了86例經PCR或免疫組織化學證實了錯配修復缺陷的一線治療失敗的腫瘤患者,并對這些病人進派姆單抗治療,結果顯示客觀反應率為53%。完全緩解率達21%。


    5月23日FDA官網批準了默沙東的PD-1抗體用于治療所有攜帶錯配修復缺陷(dMMR)的無法手術/轉移實體瘤。這是FDA歷史上第一次按照基因缺陷而不是發病組織批準抗癌藥物,反映監管部門對腫瘤藥物的新認識。


    下面進行簡單小結,今天我們交流了三個方面內容:DNA通過堿基切除、核酸切除、錯配、同源重組、非同源末端連接等方式進行修復;DNA修復缺陷與腫瘤傳統化療耐藥關系密切;DNA修復缺陷在腫瘤靶向治療如PARP抑制劑、抗PD-1免疫治療有重要的預測價值。


    在基于DNA修復缺陷腫瘤的個體化治療進程中,部分研究結果讓人歡喜,如HR缺陷、MMR缺陷腫瘤患者有了新治療靶點,但目前存在的問題仍很多很多,需要廣大臨床醫師與科學家的不懈努力!


    Part-3

    問答環節

    觀眾a:

    感謝蔡博精彩而詳實的報告,我有一個問題請教下您,在人類常見的腫瘤類型里面,有哪些常見的DNA修復相關基因突變呢?有哪些相應的潛在靶向治療藥物?

    蔡木炎老師:

    人類常見的DNA修復基因突變包括TP53,MMR,BRCA1,BRCA2,ATM等,針對BRCR突變的乳腺癌與卵巢癌目前用PARP抑制劑,而針對MMR缺陷腫瘤可采用抗PD-1治療,而ATM缺陷可以嘗試ATR抑制劑治療等。

     

    觀眾b:

    蔡博您好,腫瘤細胞常伴有DNA修復缺陷,但為什么腫瘤細胞卻比正常細胞生長更快、更有侵襲性呢?

    蔡木炎老師:

    這是很有趣的問題!機體正常細胞有完整的DNA損傷修復體系與細胞周期監控點機制,所以我們的基因組能夠相對維持穩定。而腫瘤細胞常伴有DNA修復與細胞周期監控點方面的缺陷,腫瘤細胞常出現高度可變狀態,這些突變常改變細胞的各種特性,通過細胞不斷篩選進行,最終部分細胞生存下來,導致生長更快與更強的侵襲性。

     

    觀眾c:

    蔡老師您好,請問如何判斷dMMR,請問有什么比較全的數據庫嗎?

    蔡木炎老師:

    您是指dMMR腫瘤類型數據庫,還是基因list數據庫呢?

    觀眾c:

    基因突變數據庫。

    蔡木炎老師:

    如果是腫瘤的話,TCGA里就有,針對需要dMMR的基因就可以查到。TCGA可免費下載使用。

     

    觀眾d:

    請問老師,FDA批準PD-1抗體用于MSI-H或者dMMR類型的多種實體瘤,那么臨床上如何識別這一類的腫瘤呢?

    蔡木炎老師:

    MSI常由MMR基因突變及功能缺失導致。因此,檢測腫瘤細胞中MSI狀態,可以直接檢測MSI的序列變化,也可以檢測MMR基因缺失來確定是否存在MSI。MMR基因缺陷檢測常依賴于免疫組化(蛋白水平),而MSI檢測一般依賴于分子手段如PCR檢測(MSI序列改變)。當然,現在也有文獻報道可以采用外顯子測序方法進行MSI表型檢測。但是目前臨床上檢測MSI狀態還是MMR蛋白表達與PCR檢測。


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