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    GABRA2是小鼠SCN1A和SCN8A癲癇性腦病的遺傳修飾因子
    2021-08-03

    GABRA2是小鼠SCN1A和SCN8A癲癇性腦病的遺傳修飾因子

    基因之間的相互作用在決定遺傳性疾病的嚴重程度中起主要作用。具有相同致病性變異的患者的臨床表型受遺傳背景差異和正常發育過程中基因表達隨機變異的影響。在電壓門控鈉離子通道基因中已經發現了大量的突變,可以以導致各種形式的癲癇。SCN1A突變可以導致從表型較輕的熱性驚厥到表型嚴重的Dravet綜合征等一系列表型;SCN8A突變也可以導致一系列癲癇表型,其中最嚴重的表型是一種發育性癲癇性腦病,嚴重受累的患者表現為難治性癲癇發作、發育遲緩、認知障礙、運動障礙和猝死風險增高。但是攜帶相同鈉離子通道變異的患者在臨床過程中表型可能有所不同,這表明修飾基因在決定疾病嚴重程度方面起作用。遺傳修飾因子的鑒定有助于了解疾病的發病機制并提出治療干預措施。小鼠模型為研究癲癇的遺傳基礎提供了有利工具,小鼠品系背景可以改變表型的嚴重程度,因此利用近交系小鼠之間的遺傳變異來研究并定位鈉離子通道基因的遺傳修飾因子,可以揭示其基本的生物學機制,并為鈉離子通道突變導致的癲癇治療提供干預的新靶點。本次討論中涉及的兩篇文獻,分別報道了GABRA2作為SCN1A和SCN8A所關聯的癲癇性腦病的遺傳修飾因子的發現過程。


    結果SCN1A關聯的癲癇表型遺傳修飾因子定位

    小鼠SCN1A+/-的表型高度依賴于小鼠品系:在129品系中SCN1A+/-小鼠沒有明顯的表型,小鼠的壽命也是正常的,但是當129.SCN1A+/- 與B6品系雜交得到F1,F1后代中攜帶SCN1A+/- 的小鼠在8周齡時表現出癲癇發作,并且死亡率達75%。

    通過間隔特異性同源性品系定位(interval-specific congenic Strains)將遺傳修飾位點精細定位在5號染色體上一段9Mb大小的區域。該區域包含109個已知和預測的基因,其中40個已知在大腦中表達,通過對小鼠129野生型和[129xB6]F1小鼠海馬區組織進行轉錄組測序和差異表達分析篩選出了三個候選修飾基因即Nsun7,Bend4與Gabra2。


    圖1:三個候選基因在小鼠海馬組織中的表達


    對于這三個基因進行功能挖掘發現Nsun7是一種RNA甲基轉移酶,其突變會降低人類和小鼠的精子活力;Bend4功能未知,GABRA2編碼GABAA受體α2亞基,GABRA2在抑制突觸發生中其著關鍵作用,并且GABA能信號傳導功能異常在Dravet綜合征中已被報道,因此GABRA2被確定為最佳候選修飾基因。GABRA2在小鼠不同品系前腦組織中展現出差異表達:在129/129純合品系中表達量最高,129/B6雜合品系中次之,在B6/B6純合品系中表達量最低,GABRA2蛋白的相對表達與轉錄水平一致。這意味著高水平的GABRA2表達可能在129.SCN1A+/- 品系小鼠的生存中起到保護作用。


    圖2 不同品系小鼠前腦組織中GABRA2的轉錄水平和蛋白表達量


    氯巴占是一種對GABRA2亞基具有優先親和力的抗驚厥藥物,通過對F1.SCN1A+/-的飼喂氯巴占進一步評估了GABRA2基因作為候選修飾基因和治療靶點的作用。小鼠飼喂實驗證實氯巴占對熱性驚厥有劑量依賴性的保護作用,30 mg/kg劑量的氯巴占對熱性驚厥有完全的保護作用,0.3mg/kg和1mg/kg的氯巴占可顯著提高小鼠的GTC發作閾值,分別為43.0°C(p<0.0022)和42.9°C(p<0.0079),對照組小鼠熱性驚厥發作溫度為42.3℃。


    圖3 氯巴占對熱性驚厥劑量保護作用


    SCN8A關聯的癲癇表型遺傳修飾因子定位

    小鼠前腦興奮性神經元中Scn8a-R1872W表達激活的小鼠表現為早期驚厥發作和早亡,利用攜帶R1872W變異的B6品系小鼠與其它品系小鼠分別進行雜交,結合子代的表型分析和QTL分析,鑒定SCN8A腦病的遺傳修飾因子。Scn8aR1872W/+ [B6xSJL]小鼠癲癇發作時間從40日齡至110日齡,壽命從20天至180天以上,中位生存期為66天。Scn8aR1872W/+ [B6xSJL]小鼠與B6小鼠連續回交第三代N3小鼠在20-30日齡開始出現全身性癲癇發作,中位生存期為46天。隨著與B6品系回交代數的增加,小鼠癲癇發作時間提早,壽命縮短,截至N8回交世代,突變小鼠的中位生存期降至22天。在回交過程中,SJL品系遺傳背景的比例從F2代的50%下降至N8的0.2%,說明來自SJL品系遺傳背景中保護性等位基因的缺失可能是導致存活時間縮短的原因。



    圖4 Scn8aR1872W/+,Emx1Cre/+小鼠遺傳背景與存活率關系


    通過對Scn8aR1872W/+ [B6xSJL]小鼠的數量性狀位點(QTL)分析和SNP單倍型檢測,該QTL定位在5號染色體67 Mb處的UNC9382069到82 Mb處的S6R053314276之間。在此區間內,Gabra2基因位于71Mb位置。B6小鼠和近緣品系在Gabra2基因5號外顯子的剪接受體位點的?3位置攜帶一個堿基缺失,SJL品系小鼠該位點為野生型,該剪接位點變異的純合小鼠海馬組織中Gabra2轉錄本的豐度僅為野生型的25%。對Gabra2基因型與癲癇發作表型之間的關系研究發現,Scn8aR1872W/+ [B6xSJL]小鼠中,Gabra2B/B小鼠的中位生存期為53天,明顯短于雜合Gabra2B/S和野生型Gabra2S/S小鼠的70天和79天。Gabra2B/B純合子小鼠的癲癇發作時間中位數為27日齡,早于Gabra2B/S的45日齡和Gabra2S/S小鼠48日齡。這些結果表明, B6品系的小鼠中Gabra2變異導致了小鼠的早期癲癇發作和較短存活時間等更嚴重表型。




    5 Scn8aR1872W/+,Emx1Cre F2小鼠中Gabra2剪接位點變異與癲癇發作時間和存活時間


    討論

    以上研究表明,電壓門控鈉離子通道基因SCN1A和SCN8A引起的癲癇存在多種修飾因子,可以延緩鈉離子通道基因突變引起的癲癇發作并延長攜帶突變小鼠的壽命,其中一個主要的修飾基因是定位在5號染色體上的Gabra2。Gabra2編碼GABAA受體的α2亞基,在海馬區高度表達,海馬區是癲癇發作產生的重要腦區。SCN1A功能喪失型變異(LOF,loss of function) 或SCN8A功能獲得型變異(GOF, gain of function)均可引起兩個基因各自所高度表達的抑制型神經元(inhibitory neuron)或興奮型神經元(excitatory neuron)的異常興奮而過度放電,進而導致癲癇發作。GABA抑制類神經介質與位于神經元上的GABA受體結合,調節神經元的興奮性,使其發揮正常功能(圖6)。小鼠前腦興奮性神經元中鈉離子通道基因功能獲得性突變的表達導致神經元興奮GABRA2則抑制神經元興奮度。因此增加的GABA活性可能對具有攜帶SCN1A LOF與SCN8A GOF變異的患者具有治療作用。氯巴占是GABA能神經傳遞的激活劑,對GABRA2亞基具有優先親和力,也是用作治療嚴重癲癇發作的附加藥物。因此GABRA2是SCN1A與SCN8A關聯的癲癇的潛在治療靶點。對于GABRA2變異的人群頻率研究與導致癲癇發作的單基因變異的相互作用將是未來研究的重要領域。


    圖6  GABRA2/SCN1A及GABRA2SCN8A之間可能的相互作用機制


    參考文獻:

    1. Hawkins NA, Zachwieja NJ, Miller AR, Anderson LL, Kearney JA. Fine mapping of a Dravet syndrome modifier locus on mouse chromosome 5 and candidate gene analysis by RNA‐Seq. PLoS Genet. 2016;12(10):e1006398.

    2. Yu W, Hill SF, Xenakis J, Pardo-Manuel de Villena F, Wagnon JL, et al. Gabra2 is a genetic modifier of Scn8a encephalopathy in the mouse. Epilepsia. 2020; 61(12): 2847–2856



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