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    Nat Comm | 斑馬魚模型重現VARS雙等位基因突變引起的發育性腦病伴小頭畸形
    2021-08-03

    Nat Comm | 斑馬魚模型重現VARS雙等位基因突變引起的發育性腦病伴小頭畸形

    2019年2月12日,比利時魯汶大學Peter de Witte課題組與安特衛普大學Peter De Jonghe課題組在Nature communications雜志上聯合發表了名為 《Biallelic VARS variants cause developmental encephalopathy with microcephaly that is recapitulated in vars knockout zebrafish》的研究論文。該論文在10名發育性腦病伴小頭畸形患者中篩選到了7個新的VARS基因突變,通過生物信息學分析結合體外實驗指出這些變異是通過導致基因功能喪失而致病。作者在斑馬魚中準確地重現了這些變異引起的神經系統疾病的關鍵特征。這些結果為該類神經發育疾病的遺傳學和生物學研究提供了依據,并為進一步研究氨酰-tRNA合成酶相關疾病和精準治療鋪平了道路。


    在蛋白質翻譯的早期步驟中,氨酰-tRNA合成酶催化特定氨基酸與其同源轉運RNA(tRNA)的連接。VARS編碼纈氨酸-tRNA合成酶,該研究通過國際合作或GeneMatcher計劃共納入了來自七個家庭的10例患者,所有患者都表現出全面發育遲緩和嚴重的智力障礙,達到行走年齡的9例患者中只有2例能夠獨立行走。8例患者出現癲癇發作,其中7例在新生兒或嬰兒期發作(平均發作年齡6個月,中位數4.3個月)。其他臨床特征包括肌張力低下(4例),痙攣(5例)和共濟失調步態(2例)。腦部成像顯示有8例患者出現腦萎縮,4例患者出現胼胝體萎縮或部分發育不全,4例患者出現髓鞘形成減少或髓鞘化延遲,所有患者均有嚴重的進行性小頭畸形。


    研究人員通過全外顯子測序(WES)或全基因組測序(WGS)篩選到3個VARS基因的復合雜合突變:家系I (p.Leu434Val/p.Gly822Ser)、家系 II (p.Gln400Pro/p.Arg442Gln)、家系III (p.Leu78Argfs*35/p.Arg942Gln)先前的一項大隊列研究報道了家系IV (p.Leu885Phe)和家系V (p.Arg1058Gln) 2個純合錯義突變以及家系VI和VII攜帶的純合變異p.Arg404Trp。這些變異在ExAC和gnomAD中未收錄或出現頻率極低,對于上述錯義變異,多種預測工具均預測變異有害,并且這些錯義變異均位于蛋白質催化或反密碼子結合結構域中(如圖1所示)。


    圖1 VARS基因變異的家系圖及突變位點分布


    嗜熱鏈球菌VARS蛋白及其相關tRNA復合體的晶體結構已被解析,因此作者將VARS蛋白序列與嗜熱鏈球菌VARS蛋白序列進行比對以深入了解新篩選到的錯義突變導致的蛋白結構變化及功能影響。比對發現,在篩選到的8個錯義突變中,有7個可以對應到嗜熱鏈球菌VARS序列相應的殘基上,進而可以推斷這些錯義突變對蛋白質結構或底物相互作用的影響。經過分析,p.Gln400Pro, p.Arg404Trp, p.Leu434Val, p.Arg442Gln, p.Gly822Ser, p.Arg1058Gln這6個錯義突變由于氨基酸的替換導致與附近一個或多個氨基酸殘基相互作用的穩態失衡,因此可能對蛋白質結構有直接或間接的影響,但受p.Arg404Trp及p.Arg1058Gln這兩個突變影響的殘基與附近的其他殘基沒有特別強的相互作用,因此預測影響最弱。p.Arg942Gln 改變了該蛋白與tRNA底物的直接接觸,因此可能會干擾tRNA的結合。作者又通過對VARS-tRNA復合體研究發現p.Leu885Phe變異可能影響酶與反密碼子一個或多個官能團的直接接觸(如圖2所示)。



    圖2 VARS基因突變類型的蛋白結構預測

    接下來,作者利用患者4、5(p.Leu78Argfs*35/p.Arg942Gln)的成纖維細胞研究了VARS突變后的功能變化。研究發現,與對照組相比,患者成纖維細胞中VARS蛋白顯著降低,推測p.Leu78Argfs*35變異誘導了NMD從而導致蛋白表達降低(如圖3 a所示)。免疫熒光染色結果表明,p.Arg942Gln變異不影響VARS蛋白在患者成纖維細胞中的定位(如圖3 c所示)。作者又進一步檢測了VARS蛋白的氨基?;δ?,發現來自患者成纖維細胞中的VARS蛋白活性顯著降低(如圖3 d所示)。利用家系I患者及親本的淋巴母細胞系測定VARS基因的氨基?;芰?,結果顯示攜帶p.Leu434Val / p.Gly822Ser變異的患者1和2,VARS氨基?;潭认鄬τ陔s合子親本降低了約50%,而攜帶p.Arg404Trp純合變異的患者9表現出更大的VARS催化活性損失,僅為家系I親本VARS氨基?;潭鹊?5%(如圖3 f所示)。



     圖3 體外研究VARS突變的致病性


    為了驗證VARS基因突變在體內的潛在功能影響,作者使用CRISPR/cas9技術構建了斑馬魚vars基因敲除模型。RT-PCR檢測到vars 純合突變體mRNA的缺失,雜合突變體也缺失近一半mRNA(如圖4b所示)。vars?/? 純合突變體中由于vars的缺失,導致受精后8-12天(dpf) 的幼魚過早死亡,這表明vars在斑馬魚生存中起到至關重要的作用。在觸覺響應測試中,7 dpf 時35.3%的vars純合突變體無觸覺響應,且在6 dpf 88.2%的vars純合突變體觀察到異常的運動行為,比如痙攣運動(如圖4d所示)。vars純合突變體在形態上也觀察到異常,最顯著特征是小頭畸形、部分前腦和口鼻部缺失、心包水腫等(如圖4e所示)。作者利用1-5dpf 的斑馬魚前腦切片在組織學上進一步研究了這些畸形胚胎,發現2dpf 的vars純合突變體中有細胞脫落,表明在發育早期存在有異常細胞凋亡的情況,使用caspase-3抗體檢測結果顯示在3-5dpf vars純合突變體大腦中檢測到了更多的凋亡細胞。隨著發育進程,腦部結構異常不斷發展:大腦結構破壞,下頜結構減少,視網膜分層延遲,晶狀體減少,眼周腫脹(如圖4f所示)。這些結果表明,vars的缺失會損害斑馬魚的頭部和眼睛發育并對神經元的存活至關重要。


     圖4  vars純合突變體表現出嚴重的發育表型和早期死亡


    作者通過追蹤運動軌跡研究斑馬魚行為學變化,發現vars純合突變體游動能力顯著降低(如圖5a所示),使用明暗交替刺激對斑馬魚進行適應性測試,發現vars純合突變體相較于對照組與vars雜合突變體更為活躍(如圖5b所示)。為了研究vars基因敲除是否引起異常的大腦活動,作者采用電生理實驗檢測了斑馬魚的局部場電位,發現vars純合突變體出現了類癲癇信號,并且vars純合突變的幼魚癲癇發作的比例顯著高于對照組與vars雜合突變體(如圖5c、d所示)。



    圖5  vars純合突變體表現出認知缺陷和自發性癲癇行為


    接下來作者將野生型或突變的人類VARS基因注射到vars-/- 斑馬魚胚胎中進行挽救實驗,發現野生型可以部分或全部拯救vars基因敲除引起的畸形(如圖6a-f所示)。雖然p.Gln400Pro(位于催化結構域) 和p.Arg1058Gln(位于反密碼子結合域)在蛋白模型分析預測中影響最弱,但是均無法拯救vars-/-斑馬魚的小頭畸形和腦萎縮表型,p.Arg942Gln(位于反密碼子結合域)僅部分挽救眼睛結構異常(如圖6 g-i所示)。這一結果表明盡管這些突變對VARS蛋白結構和作用機制的預測影響不同,但在vars斑馬魚敲除模型的挽救測試中, 三個突變均顯示出基因的功能喪失。


    圖6 野生型與VARS突變患者mRNA 的拯救實驗


    作者利用斑馬魚模型準確地重現了患者中所觀察到的小頭畸形及癲癇發作表型,并利用體外實驗和斑馬魚表型挽救實驗對VARS雙等位基因多個突變的致病性進行一系列研究,指出VARS雙等位基因突變的致病機理是基因功能喪失。本項工作中,斑馬魚提供了一個良好的模型系統用于測試多位點變異的遺傳影響,并可作為藥物篩選模型來尋找針對這類嚴重疾病的精準治療方法。


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