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    AJHG | KIF3B突變導致常染色體顯性纖毛病
    2021-08-02

    AJHG | KIF3B突變導致常染色體顯性纖毛病

    驅動蛋白家族(Kinesin Family,KIF)基因編碼一個基于微管的分子馬達超家族,主要負責轉運細胞內的物質。Kinesin-2作為順行纖毛內蛋白轉運 (intraflagellar transport,IFT)馬達,能夠進行纖毛的組裝和維護,其分子運動活性由KIF3A和KIF3B/KIF3C加上KIFAP3組成的異三聚體復合物驅動。已有研究表明編碼KIF的基因致病突變中已與人類至少14種不同的遺傳疾病相關,常染色體顯隱性KIF相關疾病都會影響神經系統發育。


    2020年6月,法國南特大學Bertrand Isidor和美國杜克大學Erica E. Davis課題組在AJHG發表研究論文《Mutations in the Kinesin-2 Motor KIF3B Cause an Autosomal-Dominant Ciliopathy》,探究了KIF3B突變導致常染色體顯性纖毛病的致病機理,并利用斑馬魚模型對相關機制進行驗證。本文在臨床和分子水平上表征了KIF3B的突變會導致以多指、肝纖維化、視網膜色素病變為特征的纖毛病,增加了人類纖毛病的致病基因庫,并通過斑馬魚模型眼部面積的變化、視蛋白定位錯誤和纖毛長度增加等結果進一步論證了KIF3B突變的致病機理可能是損害了Kinesin-2驅動的感光體中的纖毛運輸。

    本文中研究者在來自法國的家系A男性患者II-1中篩選到KIF3B的新發突變 c.748G> C(p.Glu250Gln),該患者有多指、肝臟畸形、視網膜色素變性等表型。在另一個不相關美國家系中篩選到了突變c.1568T> C(p.Leu523Pro),該家系六代中共有19人受累,并都患有視網膜色素變性。兩個家系的患者表型都指向纖毛疾病。而根據KIF3B蛋白結構域的研究發現(圖1),p.Glu250Gln變異位于KIF3B的驅動蛋白結構域,p.Leu523Pro變異位于KIF3B的卷曲螺旋結構域中,且兩個結構域序列在脊椎動物中十分保守。

    圖1 兩種KIF3B突變的蛋白序列和結構域分析

    為了表征在人類中鑒定的KIF3B突變誘導的細胞表型,研究者將個體1(家系A,II-1)中分離的成纖維細胞進行培養,并計算初級纖毛細胞比例和纖毛長度,結果顯示纖毛細胞比例與正常對照組無差異,但纖毛長度顯著增加,較對照平均增加36%(圖2)。

    圖2 個體1成纖維細胞纖毛細胞比例和纖毛長度分析

    為驗證KIF3B突變導致的纖毛長度異常,研究者將兩種突變和陰性對照p.Val435Ile轉染到永生化視網膜色素上皮細胞系hTERT-RPE1細胞中,結果表明(圖3)兩種突變都會顯著增加細胞纖毛長度,空載體和陰性對照對纖毛長度則無影響。

    圖3 細胞模型纖毛長度分析

    為了進一步研究帶有p.Glu250Gln或p.Leu523Pro變異KIF3B蛋白的穩定性,研究者將轉染后的HEK293細胞和對照組暴露于環乙酰亞胺中2小時及4小時,結果顯示(圖4)帶有突變的蛋白的降解速率與野生型相比未顯著改變,證明突變不影響蛋白穩定性。

    圖4 兩種突變蛋白的穩定性分析

    為探討p.Glu250Gln和p.Leu523Pro突變的顯性致病作用,研究者將對應突變的mRNAs注射進斑馬魚胚胎中,結果表明(圖5)p.Glu250Gln(25、50 pg)兩組幼魚眼部面積與注射野生型mRNA組相比顯著減少,過高的mRNA劑量會導致胚胎大量死亡,細胞凋亡實驗也發現p.Glu250Gln突變會導致幼魚視網膜細胞凋亡增加。將野生型和p.Glu250Gln突變的mRNA以2:1的比例注射進胚胎中,可使得幼魚眼部面積恢復正常。該實驗證明p.Glu250Gln突變對眼部形態和發育有特異性作用。

    圖5 突變對斑馬魚眼部面積及視網膜細胞凋亡的影響

    在斑馬魚視網膜中,kif3b會對光感受器的形成和功能產生影響,而kif3b突變會導致視紫紅質運輸方面的缺陷,因此研究者通過視網膜切片進行視紫紅質的定位。如圖6A-C所示,注射p.Leu523Pro(50 pg)和p.Glu250Gln(50 pg)兩組幼魚的視桿細胞內段(RIS,rod inner segment)視紫紅質顯著增加,共注射100 pg 野生型人類KIF3B mRNA則可挽救兩種突變的表型。而圖6E、F表明兩種突變組連接感光體的纖毛長度顯著增長。以上結果證明KIF3B功能與桿狀光感受器完整性和視蛋白運輸相關。

    圖6 突變對斑馬魚視紫紅質定位和纖毛長度的影響


    參考文獻:Cogné B, Latypova X, Senaratne LDS, et al. Mutations in the Kinesin-2 Motor KIF3B Cause an Autosomal-Dominant Ciliopathy. Am J Hum Genet. 2020;106(6):893-904. DOI:10.1016/j.ajhg.2020.04.005


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