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    賽福助力|揭秘同義突變和深度內含子變異導致遺傳性癲癇
    2021-08-02

    賽福助力|揭秘同義突變和深度內含子變異導致遺傳性癲癇

    圖片

    貴陽市兒童醫院兒科神經內科專家通過對15例臨床表現高度懷疑遺傳性癲癇,但基因未確診患者的家系全外(trio-WES)數據進行回顧性分析,發現了兩個疑似異常剪接事件,進一步通過功能驗證實驗,揭示了兩例遺傳性癲癇患者的遺傳學病因。賽?;騾⑴c了該項研究工作的數據分析、功能驗證實驗等臨床科研轉化工作,研究結果共同發表于BMC Medical Genomics (影響因子 3.8)。



    • 研究背景:


    全外顯子組測序(WES)方法在檢測癲癇患者的致病變異方面非常成功,有研究表明,對于單基因遺傳病,trio-WES的陽性診斷率高達28-55%。然而,由于一些其它的因素,如:生物信息學預測流程不完善、變異解釋不準確或致病性證據不足,使得檢測到的變異難以明確其致病性,從而導致一些臨床高度懷疑的的遺傳性癲癇無法得到基因確診。

    長期以來,異常剪接被認為是罕見遺傳疾病的主要原因。RNA前體(Pre-mRNA)的剪接依賴于外顯子-內含子剪接位點、調控序列的精確識別,以及剪接體snRNP與剪接因子的相互作用,任何錯誤和不準確的過程都可能導致異常剪接。

    深度內含子變異可能會導致新的剪接位點的產生,進而導致無義介導的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)或截斷蛋白;外顯子區域的同義突變也可能通過引入新的剪接位點、激活隱蔽剪接位點或中斷外顯子剪接增強子來影響剪接。

    深度內含子變異通常無法被WES檢測到;外顯區域的同義突變也很容易由于軟件預測的無害性而在數據分析過程中被忽略。

    在本項研究中,通過對2019年7月至2020年6月收集的15例臨床表現高度懷疑遺傳性癲癇(Dravet綜合征,DS;遺傳性癲癇伴熱性癲癇發作,GEFS+;良性家族性新生兒癲癇,BFNE),但基因未確診患者的家系全外(trio-WES)數據進行回顧性分析,發現了同義突變和深度內含子變異兩個異常剪接事件,進一步通過體外minigene實驗證明這兩個異常剪接事件可能是未確診疾病的遺傳學原因。


    • 案例回顧:


    家庭1:先證者III-6,男性,1歲;第一次癲癇發作發生在4個月大,發作類型以廣泛性發作為主,短期聚集性發作頻繁;圍產期未見異常;在癲癇發作前后發育正常;血液生化、腦脊液檢查正常;腦成像正常;在發作間期腦電圖未檢測到癲癇放電;低劑量鈉通道阻滯劑奧卡西平(OXC)和丙戊酸鈉(VPA)對癲癇控制有明顯效果(由于患者對OXC過敏,使用VPA替代OXC);患者七個月無癲癇發作,并停用 VPA。該家系有廣泛的癲癇發作家族史(詳見圖1A):9名家庭成員從新生兒期到3個月左右有多次或頻繁發作的病史,從幾個月到一歲半停止發作,發育正常。根據國際抗癲癇聯盟 (ILAE) 分類,患者被診斷為 BFNE。
    家庭2:先證者III-2,男性,3歲11個月;他被診斷為GEFS +,并有廣泛的發熱性癲癇發作(FS+)家族史,從6個月到2歲,他有四次發熱性癲癇發作;2歲后轉為無熱抽搐,并在醒和睡時強直陣攣性發作;圍產期未見異常;他的父親(II-3)、姑姑(II-2)和堂兄(III-1)在5歲之前分別都有過幾次發熱性癲癇發作,隨后正常(詳見圖1B)。


    • 基因檢測:


    家庭1:基因檢測結果回顧性分析發現患者在KCNQ2基因上存在一同義突變NM_172107.3:c.1617_C > T(p.Ser539=),該變異根據ACMG被判讀為“臨床意義不明(VOUS)”。應用sanger測序擴大家系驗證,結果表明該變異遺傳自與先證者表型相似的父親,且臨床表型相似的祖母、姑姑 、堂兄弟(圖1A),而無表型的母親、同胞姐妹及爺爺在該位點則表現為野生型。

    家庭2:WES數據回顧性分析未發現可疑變異,但根據患者表型,臨床高度懷疑SCN1A基因為其致病基因。根據以往該基因的文獻報道,針對SCN1A基因的23號內含子設計特異性擴增引物,并進行sanger測序。測序結果發現,23號內含子中存在一變異NM_001165963.2:c.4002 + 2461_T > C。該變異經SpliceAI軟件預測,顯示下游28 bp的供體增益為0.18,上游35 bp的受體增益為0.18,表明存在內含子滯留。應用sanger測序擴大家系驗證,驗證結果表明該變異遺傳自與先證者表型相似的父親 ,且此變異在該家系中共分離(圖1B)。



    圖1 患者遺傳家系圖譜


    • 功能驗證:


    KCNQ2:c.1617_C > T變異體外實驗結果:體外構建minigene載體,轉染人細胞系Hela和HEK-293T,RT-PCR分析顯示,與野生型相比突變體顯示剪接異常;測序結果顯示,該同義突變由于激活了14號外顯子中的一個新的隱蔽的5 '供體剪接位點,導致了更短的轉錄本和20 nt的缺失(圖2A, B),該轉錄本預測會產生一個截斷蛋白(p.Val537Cysfs*39)(圖2C)。



    圖2 


    SCN1A:c.4002 + 2461_T > C變異體外實驗結果:體外構建minigene載體,轉染人細胞系Hela和HEK-293T,RT-PCR結果顯示突變體的產物較野生型長;測序結果表明變異體激活了隱蔽剪接位點,導致64 nt內含子滯留(圖3);預測64 nt片段的插入將在變異后的65位氨基酸位置導致翻譯終止(p.Val1294Aspfs*65)(圖4B)



    圖3



    圖4 

    • 討論:


    有研究表明,孟德爾疾病中約9-30%的致病變異是異常剪接導致的,然而,在人類基因突變數據庫 (HGMD) 中收錄的所有突變,只有 8.6%是剪接突變(HGMD數據庫,更新至2020年6月),因此,影響剪接的同義突變和深度內含子變異的綜合研究可對提高罕見病患者的診斷率大有裨益。


    在本項研究中,我們報告了兩個WES遺漏的重要變異:

    (1)SCN1A:c.4002 + 2461_T > C由于其位于深度內含子而未被外顯子組測序發現;

    (2)KCNQ2:c.1617 _C > T被常規生信分析流程忽略;

    我們通過進一步的功能實驗揭示了這兩個異常剪接事件是未確診疾病的遺傳學原因。

    以上案例提示我們,對于那些有家族史,且臨床高度懷疑是由遺傳因素導致的病例,在WES陰性的情況下,應特別注意一些容易被忽略的同義突變/深度內含子變異,并結合生物信息學軟件和功能實驗來揭示未確診疾病的遺傳學病因。


    來源:BMC Medical Genomics


    原文鏈接:Unraveling?synonymous?and?deep?intronic?variants?causing?aberrant?splicing?in?two?genetically?undiagnosed?epilepsy?families


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